Saúde masculina

PCR (reação em cadeia da polimerase)

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Não muito tempo atrás, um método confiável, altamente sensível e rápido para o diagnóstico de várias doenças humanas infecciosas foi desenvolvido. Este método é chamado de "análise de PCR". O que é, qual é a sua essência, o que os microrganismos podem revelar e como acertar, vamos dizer em nosso artigo.

Histórico de descobertas

O cientista americano Carey Mullis, em 1983, inventou um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) .O método de diagnósticos da Cetus Corporation, no qual seu criador funcionava, foi originalmente patenteado. Mas em 1992, todos os direitos e patentes foram vendidos para a Hoffman-La Roche. Depois disso, descobriu-se que estudos paralelos semelhantes foram realizados e registrados por outros biólogos americanos, como Alice Chan, David Edgar e John Trell. Em 1980, os cientistas soviéticos A. Slyusarenko, A. Kaledin e S. Gorodetsky também lidaram com este problema. Portanto, não foi possível determinar o detentor dos direitos exclusivos. Muitos eminentes bioquímicos deram uma contribuição definitiva para o desenvolvimento da metodologia de PCR e patentearam suas inovações. No momento, a análise de PCR é realizada em todos os lugares em laboratórios especialmente equipados.

Por que o diagnóstico de PCR tem esse valor?


Uma das vantagens significativas do método de PCR é a alta sensibilidade - de 95 a 100%. No entanto, esses benefícios devem basear-se na observância indispensável das seguintes condições:

  1. coleta correta, transporte de material biológico,
  2. disponibilidade de instrumentos estéreis, descartáveis, laboratórios especiais e pessoal treinado,
  3. adesão estrita aos métodos e esterilidade durante a análise
A sensibilidade é diferente para diferentes micróbios detectáveis. Por exemplo, a sensibilidade do método de PCR para detectar o vírus da hepatite C é de 97-98%, a sensibilidade para detectar o ureaplasma é de 99-100%.

As possibilidades inerentes à análise de PCR permitem-nos alcançar uma especificidade analítica insuperável. Isso significa a identificação do microorganismo que você estava procurando, e não semelhante ou intimamente relacionado.
A sensibilidade diagnóstica e a especificidade do método de PCR são frequentemente superiores às do método de cultura, denominado “padrão ouro” para a detecção de doenças infecciosas. Dado o período de cultivo da cultura (de vários dias a várias semanas), a vantagem do método PCR torna-se óbvia.

PCR no diagnóstico de infecções
As vantagens do método de PCR (sensibilidade e especificidade) determinam uma ampla gama de aplicações na medicina moderna.
As principais aplicações dos diagnósticos de PCR:

  1. diagnóstico de doenças contagiosas agudas e crônicas de vária localização
  2. monitorar a eficácia da terapia
  3. especificação do tipo de patógeno
A PCR é utilizada em obstetrícia, ginecologia, neonatologia, pediatria, urologia, venereologia, nefrologia, clínica de doenças infecciosas, oftalmologia, neurologia, fisiopulmonologia, etc.

O uso de diagnósticos de PCR é realizado em conjunto com outros métodos de pesquisa (ELISA, PIF, REEF, etc.). Sua combinação e conveniência são determinadas pelo médico assistente.

Patógenos infecciosos detectados por PCR

Vírus:

  1. retrovírus HIV-1 e HIV-2
  2. vírus herpetiformes
  3. herpes simplex virus type 1 and 2
  4. citomegalovírus
  5. Vírus Epstein-Barr
  6. vírus varicela - zoster
  7. herpes vírus humanos 6 e 7
  8. hepatite C, B e A
  9. papilomavírus humano
  10. vírus da rubéola
  11. adenovírus
  12. rinovírus
  13. parvoviruses
  14. picornovírus

Bactérias:
  1. micobactéria
  2. clamídia
  3. micoplasma
  4. salmonela
  5. legionella
  6. Clostridiums
  7. treponema pálido
  8. vários tipos patogênicos de E. coli
  9. Vibrio cholerae
  10. Rickettsia
  11. Staphylococcus aureus
  12. agente causativo bacteriano da meningite
  13. Helicobacter pylori
  14. ureaplasma
  15. agente causativo de gonorreia
  16. vareta da difteria
  17. bacilo hemofílico

Esta lista contém os agentes infecciosos mais comuns detectados por PCR. De fato, essa lista é muito mais ampla, constantemente atualizada, à medida que novas “sementes” são sintetizadas. Também deve ser notado que a lista de patógenos identificados é determinada pela presença de “primers” para identificação no arsenal de cada laboratório específico.

Qual é a essência da reação em cadeia da polimerase?

A pesquisa de PCR é uma conquista e uma grande conquista da biologia molecular. Trata-se de um método que, ao detectar microsites de DNA ou RNA de material genético estranho (genoma), é capaz de reconhecer características individuais inerentes a um único tipo de microorganismo, sem confundi-lo com outro. Como funciona o método de PCR e como ele consegue restaurar a imagem do comportamento de uma célula infecciosa em um organismo vivo?

Processo de PCR

Então, um fragmento de ácido nucléico foi encontrado, mas está sozinho e não é suficiente para realizar a reação, portanto é codificado (cópia). No entanto, para o processo posterior, um grande número dessas microplacas é necessário, o que pode garantir sua reprodução completando novos segmentos de DNA idênticos ao fragmento encontrado (replicação). A reprodução é uma característica natural e inerente de um ácido nucleico que será replicado usando enzima polimerase mesmo fora de um organismo vivo (em um tubo de ensaio com uma amostra), formando muitos clones, ou seja, ele irá reação em cadeia. Todos os novos e novos fragmentos serão clonados, mas apenas aqueles em que o pesquisador estiver interessado. É por isso que É importante fazer uma análise “pura”, sem impurezas, e realizar o teste com muito cuidado.

Dada a capacidade da reação em cadeia da polimerase listada, pode-se adivinhar porque ela distingue tão facilmente o ureaplasma do micoplasma, ou cada um deles da clamídia.

Assim, mesmo se entre os milhões de células do corpo humano, não o próprio vírus vivo for perdido, mas apenas uma parte do seu DNA, então PCR, se nada o impedir, provavelmente irá lidar com a tarefa e relatar a presença do “alienígena” com um resultado positivo. Esta é a essência da PCR e sua principal vantagem.

Pontos fortes e fracos

O laboratório que executa diagnósticos de PCR tem os mais altos requisitos em termos de equipamentos, sistemas de teste e qualificações do pessoal médico. Este é um laboratório de alta tecnologia com um arsenal de reagentes altamente sensíveis e altamente específicos, por isso não tem quaisquer inconvenientes específicos. É isso que dá um resultado positivo na ausência de manifestações clínicas, e assim coloca a clínica diante do dilema: devo começar o tratamento ou não?

O médico, observando o paciente, começa a duvidar da confiabilidade dos resultados do exame, pois não vê sinais da doença. Mas ainda Dada a alta sensibilidade do sistema de PCR, deve ser lembrado que ele detecta o patógeno mesmo no estágio pré-clínicoe um resultado positivo neste caso é mais vantagem do que uma desvantagem. Com base nisso, o médico assistente deve decidir sobre a adequação da terapia, levando em consideração outros prós e contras.

As vantagens dos diagnósticos usando a reação em cadeia da polimerase são óbvias:

  • Alta especificidadeatingindo 100%, devido à presença na amostra de partículas de ácidos nucléicos inerentes a um organismo particular, mas estranhas ao homem,
  • Alto desempenhoporque a PCR é uma técnica automatizada de alta tecnologia que fornece a capacidade de realizar testes no dia de retirar o material e livrar-se do paciente de perturbações desnecessárias,
  • A PCR, trabalhando em uma amostra, é capaz de conduzir vários estudos edetectar vários patógenos, se ela for essa tarefa. Por exemplo, no diagnóstico de infecção por clamídia, em que a PCR é um dos principais métodos, juntamente com a clamídia, é possível detectar a neisseria (gonococo), o agente causador da gonorréia. Além disso, a confiabilidade dos resultados não é afetada negativamente,
  • PCR testando vocêmostra microrganismos perigosos no período de incubaçãoquando não tiveram tempo de infligir danos significativos ao corpo, isto é, o diagnóstico precoce alerta para o desenvolvimento iminente do processo patológico, que possibilita prepará-lo e levá-lo totalmente armado.

Além disso, a fim de evitar mal-entendidos, às vezes surgindo durante o diagnóstico, a PCR se protege pelo fato de que seus resultados podem ser corrigidos (foto, computador) com o propósito de usá-los para finalidades especializadas, se necessário.

Uma resposta negativa é considerada normal nas respostas da PCR., indicando a ausência de fragmentos de ácidos nucléicos estranhos, uma resposta positiva indicará a presença de infecção no organismo, valores digitais indicam o estado do vírus e sua concentração no momento do teste. No entanto, uma decodificação completa da análise é realizada por um médico que passou por um estudo especial sobre o tema da PCR. Tentar interpretar os resultados por conta própria não faz sentido, uma vez que é possível, como é provável que aconteça, interpretar mal e começar a preocupar-se antecipadamente.

O que o PCR "teme", o que é capaz de fazer e como se preparar para isso?

Como em quaisquer outros estudos, por vezes, os resultados dos testes revelam ser falso positivo ou falso negativoonde PCR não é exceção. Isso pode acontecer nos seguintes casos:

  1. Violações do processo em um estágio da reação,
  2. Inobservância das regras para a coleta de material, seu armazenamento ou transporte,
  3. A presença de impurezas no material.

Isto sugere que o diagnóstico de infecções por PCR deve ser abordado com cuidado, cuidado e cuidado, caso contrário, as amostras do material podem alterar sua estrutura estrutural ou mesmo colapsar.

Estágios do diagnóstico de PCR. Resultados falsos podem causar irregularidades em qualquer fase do estudo.

O diagnóstico por PCR de infecções pertence à categoria de "padrões de ouro" entre outros métodos de laboratório, por isso pode ser usado para pesquisar patógenos de muitas doenças que, à primeira vista, não têm nada em comum entre si:

  • Tuberculose de vária localização, pneumonia (inclusive atípico, causado por clamídia),
  • Infecções infantis (rubéola do sarampo, parotidite, sarampo),
  • Difteria,
  • Salmonelose,
  • Doença infecciosa zoonótica - listeriose (a doença é caracterizada por uma variedade de sintomas com danos aos gânglios linfáticos, sistema nervoso central, órgãos internos),
  • Doenças causadas pela penetração do vírus de Epstein-Barr (mononucleose infecciosa, etc.),
  • Patologia do câncer provocada pela infecção pelo HPV (HPV e seus tipos),
  • Borreliose (doença de Lyme, encefalite transmitida por carrapatos),
  • Infecção por Helicobacter pylori, causada pelo micróbio humano Helicobacter pylori que vive no estômago humano. Está comprovado que o Helicobacter causa câncer de estômago ou duodeno 12,
  • Candidíase e praticamente todas as doenças sexualmente transmissíveis.

O diagnóstico por PCR de infecções sexualmente transmissíveis é de particular importância, uma vez que as doenças assim causadas costumam prolongar-se por muito tempo sem manifestações clínicas, mas tornam-se mais ativas durante a gravidez e ameaçam a saúde e até a vida da criança. Infecções TORCH também se comportam de forma semelhante. Algumas delas (“grudadas”) aplicam-se simultaneamente às ISTs, portanto, estas requerem uma consideração mais detalhada. O leitor será capaz de se familiarizar com as técnicas mais populares nas seções seguintes do artigo.

Como se preparar adequadamente para obter um resultado confiável?

Imediatamente, notamos que a preparação para PCR é bastante simples, não exigindo nenhum esforço especial por parte do paciente. Você só precisa completar três tarefas simples:

  1. Não tenha relações sexuais 24 horas antes do teste,
  2. Para a coleta e análise de sangue de uma veia, você precisa vir com o estômago vazio, a propósito, também é impossível beber,
  3. A entrega de urina deve ser feita durante a noite (de manhã - em um frasco estéril, comprado no dia anterior na farmácia).

PCR pode funcionar em qualquer ambiente biológico

O método de PCR não é “sanguinário”, portanto aceita qualquer meio biológico contendo o agente infeccioso suspeito. a escolha - o que você precisa levar para pesquisa, permanece para o doutor.

Assim, na busca por um patógeno, além de um exame de sangue (embora também caiba e na maioria dos casos é feito paralelamente a outro material), você pode usar:

  • Esfregaço (secreção do trato urogenital),
  • Raspagem das membranas mucosas da boca, conjuntiva, nasofaringe, trato genital (as mulheres tiram do colo do útero e da vagina, os homens - da uretra),
  • Saliva
  • Cum
  • Suco de próstata,
  • Tecidos placentários e líquido amniótico (líquido amniótico),
  • Sedimento de urina (após centrifugação), por exemplo, para detectar algumas IST e Mycobacterium tuberculosis,
  • Escarro e líquido pleural para o mesmo fim
  • Exsudados
  • Líquido cefalorraquidiano em casos de suspeita de lesão infecciosa do sistema nervoso central,
  • Material de biópsia (biópsia), retirada do fígado, duodeno, estômago, etc.

Eu gostaria de acrescentar que o material para testes em todos os casos, mesmo em raspagens e excreções, será suficiente, pois o teste do método de PCR não requer grandes volumes, há análise suficiente e alguns microlitros, que são geralmente levados para um microtubo tipo Eppendorf e enviados para pesquisa.

HIV e reação em cadeia da polimerase

Normalmente, ao passar por uma pesquisa anônima em caso de resultados positivos de immunoblotting, o diagnóstico da infecção pelo HIV é repetido de novo. Se o diagnóstico for confirmado, o paciente é prescrito estudos adicionais:

  1. Usando reações imunológicas para determinar os valores absolutos do número de linfócitos CD4 (células imunocompetentes - T-ajudantes ou ajudantes), que a infecção atinge em primeiro lugar, após o que eles perdem suas propriedades básicas e não podem distinguir entre "seus" e de outra pessoa. " O RNA do vírus que circula no plasma sanguíneo é tomado como células normais do corpo e não reage a elas,
  2. Detecção de RNA de vírus por PCR e cálculo da concentração de partículas virais a fim de estabelecer o estágio, a gravidade do processo patológico e o prognóstico com base nesses dados. É claro que a palavra “norma” a esse respeito não existe, já que a reação é sempre positiva, e decifrar os valores numéricos é da competência do médico.

PCR e hepatite

Os patógenos da hepatite C podem ser detectados por PCR, na maioria das vezes o teste é usado para diagnosticar a hepatite C, que é mal detectada por outros métodos.

O vírus da hepatite C (contendo RNA) em seu comportamento no corpo humano se assemelha ao HIV. Envolvendo-se no genoma das células do fígado (hepatócitos), ele fica lá esperando pela hora, que pode chegar depois de dois anos, pelo menos 20 anos, então os médicos o chamam de "um assassino suave". A hepatite C leva à formação de um processo maligno no parênquima hepático, que se manifesta nos últimos estágios. O sistema imunológico não percebe todos esses eventos, tomando o vírus para um hepatócito. É verdade que anticorpos para o vírus em algumas quantidades são produzidos, mas eles não fornecem uma resposta imune decente. Para o diagnóstico de ELISA para hepatite C não é muito informativo, porque indica que o vírus deixou rastros, e se ele mesmo deixou é desconhecido. Em casos de HCV de autocura são conhecidos, enquanto os anticorpos contra o vírus permanecem e continuam circulando por toda a vida (memória imunológica). PCR significativamente à frente da formação de anticorpos e pode detectar uma partícula viral após 1-1,5 semanas, enquanto os anticorpos podem aparecer na faixa de 2 meses a seis meses

O diagnóstico por PCR no caso de suspeita de uma compulsão do vírus da hepatite C no corpo humano é o método mais ideal de pesquisa, porque somente ele é capaz de reconhecer a presença de um “inimigo tenro” na biópsia do sangue ou do fígado do paciente.

No entanto, às vezes, há casos em que a AT é positiva e o resultado da PCR é negativo. Isso às vezes acontece com uma quantidade muito baixa de vírus ou quando está "inativa" no fígado sem entrar na corrente sanguínea. Para encontrar a verdade, o paciente é reanalisado, ou até mais do que um.

Infecção por papilomavírus humano

O HPV (vírus do papiloma humano), caso não ocorra a autocura, pode também, sem se manifestar, persistir por muito tempo no organismo do hospedeiro, o que nem é suspeito, já que a PCR não foi realizada e os sintomas estavam ausentes. No entanto, a presença de infecção pelo papilomavírus humano, embora latente, está longe de ser indiferente à saúde humana, onde certos tipos de vírus causadores de câncer são particularmente perigosos (tipos 16, 18).

Mais frequentemente, a metade feminina da população sofre de HPV, pois o vírus ama mais o genital feminino, especialmente o colo do útero, onde alguns tipos de vírus contribuem para o desenvolvimento de processos displásicos e, depois, o câncer cervical, se você não tratar a displasia e dar rédea livre ao vírus. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

Infecções da TOCH e DSTs são tão inter-relacionadas que às vezes é difícil determinar a qual grupo um determinado patógeno deve ser atribuído. Eles são geralmente difíceis de entender, pois são grupos bastante diversos de microrganismos que podem ser sempre transmitidos sexualmente ou apenas sob certas condições (imunodeficiência), e podem ser de interesse somente durante a gravidez, devido ao possível impacto negativo em seu curso e no feto.

PCR - o principal método para detectar infecções ocultas

O desenvolvimento de manifestações clínicas é baseado em vários patógenos, que só podem ser encontrados por PCR, que é sua principal tarefa, às vezes em conjunto com ELISA, e às vezes como o único teste confirmatório, especialmente se os sintomas da doença estiverem ausentes. Tal situação difícil pode criar uma infecção polimicrobiana que, além de agentes causadores evidentes, também inclui patógenos oportunistas.

Em homens que sofrem de doenças inflamatórias da esfera genital, por exemplo, uretrite, clamídia, ureaplasma e micoplasma são frequentemente detectados. Esses mesmos tipos são perigosos e o corpo feminino. Aqueles que conhecem a perfídia da clamídia e certamente já se deparam com a dificuldade de encontrá-la e reconhecê-la, portanto, a análise feita pela PCR na clamídia é especialmente confiável, porque o parasita escondido em uma célula de dimensões muito pequenas se comporta com cautela e sempre prejudica sub-repticiamente.

O ureaplasma é frequentemente considerado emparelhado com micoplasma. E isso não é um acidente. Essas espécies, como a clamídia, não são vírus nem bactérias, vivem dentro das células e pertencem às ISTs, embora sua presença em um organismo saudável também esteja longe de ser incomum. Assim, para distinguir um portador saudável de uma pessoa doente, são necessários métodos especiais onde a PCR é considerada a mais confiável, pois, devido à natureza da estrutura e do comportamento desses microrganismos, outros estudos são ineficazes.

Quanto ao vírus do herpes (tipo 1, 2) e citomegalovírus, que também pertence ao vírus do herpes (tipo 5), a situação aqui também é ambígua. A infecção da população mundial se aproxima de 100%, portanto, neste caso, a identificação do vírus e sua dose é muito importante, o que desempenha um papel importante durante a gravidez, porque um adulto que se enraizou em seu corpo muitas vezes não causa nenhum problema e não dá sinais da doença.

Portanto, um exame semelhante prescrito por um médico não deve ser ignorado, porque em alguns casos a reação em cadeia da polimerase é um método indispensável e necessário de diagnóstico laboratorial que pode proteger não apenas uma mulher, mas também uma pessoa pequena de complicações sérias.

Em conclusão, eu gostaria de observar que um método tão maravilhoso, como o PCR, tem servido a humanidade por mais de 30 anos. Ao mesmo tempo, as tarefas do teste não se limitam à busca de patógenos de doenças infecciosas. A reação em cadeia da polimerase, nascida com base na biologia molecular, está inextricavelmente ligada à genética. usado com sucesso em análise forense para identificação pessoal, na medicina forense para o estabelecimento da paternidade, em medicina veterinária, se a clínica para animais tiver a oportunidade de adquirir equipamentos caros, bem como em outras áreas (indústria, agricultura, etc.).

A essência do método de diagnósticos de PCR

Análise de PCR: o que é e como funciona? A essência do método consiste em usar uma enzima DNA polimerase especial in vitro para aumentar o volume de um determinado ambiente microbiano. Para fazer isso, multiplique o material de DNA disponível. Assim, na presença de um microrganismo patogênico na amostra, sua quantidade será aumentada devido a manipulações laboratoriais bioquímicas, e a bactéria não será difícil de detectar em um microscópio.

Como é o material de pesquisa?

Para a análise necessária:

  • Matriz de DNA
  • primers conectando as extremidades de um pedaço de material
  • enzima DNA polimerase resistente ao calor,
  • produtos químicos que fazem enzimas funcionar corretamente,
  • solução tampão necessária para criar condições adequadas para o crescimento e desenvolvimento de material de DNA.

Para realizar a PCR, realizar 25-30 repetições, consistindo de três etapas: desnaturação, recozimento e alongamento.

Para a análise da reação em cadeia polimezar usando um dispositivo especial - o amplificador. Equipamentos modernos permitem que você instale o programa necessário de tubos de aquecimento e resfriamento para eliminar erros durante o diagnóstico.

Onde o diagnóstico é aplicado?

O método de reação em cadeia do polimele é usado em vários campos da medicina:

  • criminologistas usam para identificar material genético, como cabelo, saliva ou sangue,
  • Um teste de sangue de PCR ajuda na genotipagem, por exemplo, para detectar uma reação individual geneticamente incorporada a um medicamento específico,
  • usando este método, estabeleça a existência de parentesco entre as pessoas
  • O método de PCR mais popular tornou-se em diagnósticos médicos para a determinação de várias doenças infecciosas.

Quais infecções a PCR revela?

Assim, a medicina tem longo e usado com sucesso a análise de PCR. O que é, nós já aprendemos. E quais patógenos podem ser detectados com isso? As seguintes doenças infecciosas são diagnosticadas por PCR:

  • Hepatite A, B, C,
  • ureaplasmosis,
  • candidíase
  • clamídia
  • micoplasmose
  • Gardnerelose
  • mononucleose infecciosa,
  • tricomoníase
  • infecção pelo papilomavírus humano
  • tuberculose,
  • infecção por herpes do primeiro e segundo tipos,
  • helicobacteriose,
  • citomegalovírus,
  • difteria,
  • salmonela,
  • Infecção pelo HIV.

Além disso, métodos de PCR são usados ​​no diagnóstico de câncer.

Vantagens do método

Diagnóstico de PCR tem várias vantagens:

  1. Alta sensibilidade. Mesmo com apenas algumas moléculas de DNA de um microorganismo, a análise de PCR determina a presença de infecção. Ajudará o método para doenças crônicas e latentes. Muitas vezes, em tais casos, o microorganismo é inculto por outros meios.
  2. Qualquer material é adequado para pesquisa, por exemplo, saliva, sangue, secreções genitais, cabelo, células do epitélio. O mais comum é um exame de sangue e esfregaço urogenital na PCR.

Recomendações para preparação para análise

Para que os resultados sejam confiáveis ​​durante a realização de um estudo de PCR, é necessário passar a análise, seguindo as recomendações sobre a preparação preliminar para o diagnóstico:

  1. Antes da entrega da saliva deve abster-se de comer alimentos e remédios por 4 horas antes da coleta do material. Imediatamente antes do procedimento, lave a boca com água fervida.
  2. As regras acima devem ser seguidas ao tirar uma amostra do interior da bochecha. Depois de enxaguar, recomenda-se realizar uma leve massagem da pele para destacar o segredo da glândula.
  3. A urina é geralmente coletada em casa. Para isso, você precisa segurar um vaso sanitário cuidadoso dos genitais. Em um recipiente de plástico estéril, 50 a 60 ml de urina devem ser coletados. Para garantir a pureza do material, recomenda-se que as mulheres insiram um tampão na vagina e que os homens puxem a dobra da pele o máximo possível. Você não pode passar o material durante o período menstrual.
  4. Para doar esperma, você precisa se abster de intercurso por 3 dias antes de pegar o material. Além disso, os médicos aconselham a não ir à sauna e tomar um banho quente, beber álcool e alimentos picantes. 3 horas antes da análise você precisa abster-se de urinar.
  5. Para a entrega de um esfregaço urogenital, por exemplo, se a clamídia por PCR estiver sendo analisada, recomenda-se que mulheres e homens tenham repouso sexual por 3 dias. 2 semanas antes da análise não pode tomar medicamentos antibacterianos. Por uma semana você precisa parar de usar géis íntimos, pomadas, supositórios vaginais, duchas. 3 horas antes do teste, você deve abster-se de urinar. Durante a menstruação, o material não é coletado, apenas 3 dias após a cessação da descarga de sangue, um esfregaço urogenital pode ser feito.

PCR durante a gravidez

Enquanto espera por um bebê, muitas infecções sexualmente transmissíveis são extremamente perigosas para o desenvolvimento normal do feto. As DSTs podem provocar retardo de crescimento intra-uterino, aborto espontâneo ou parto prematuro e malformações congênitas de uma criança. Portanto, é extremamente importante realizar o exame de PCR no início da gravidez. Para passar a análise é necessário para o registro - até 12 semanas.

O material é retirado do canal cervical usando uma escova especial. O procedimento é indolor e não representa um perigo para o bebê. Geralmente durante a gravidez, a clamídia é analisada pelo método de PCR, bem como por ureaplasmosis, micoplasmose, citomegalovírus, herpes, papilomavírus. Uma pesquisa tão complexa chamada PCR-6.

PCR para diagnóstico do HIV

Devido ao fato de que a reação em cadeia da polimerase é muito sensível a mudanças no corpo e às condições de diagnóstico, muitos fatores podem afetar o resultado. Portanto, a análise de PCR para a infecção pelo HIV não é um método confiável, sua eficácia é de 96% a 98%. Nos restantes 2-4% dos casos, o teste dá resultados falso-positivos.

Mas em algumas situações, é impossível fazer sem o diagnóstico de PCR do HIV. Normalmente executa-se a pessoas com um resultado falso-negativo de ELISA. Tais indicadores sugerem que uma pessoa ainda não desenvolveu anticorpos para o vírus e é impossível detectá-los sem um aumento múltiplo no número. Isto é o que pode ser alcançado através da realização de um exame de sangue usando o método de PCR.

Tal diagnóstico também é necessário para crianças do primeiro ano de vida de uma mãe soropositiva. O método é a única maneira de determinar com segurança o status da criança.

PCR para o diagnóstico de hepatite

O método de reação em cadeia da polimerase permite detectar o DNA do vírus da hepatite A, B, C muito antes da formação de anticorpos contra a infecção ou o aparecimento dos sintomas da doença. A análise de PCR para hepatite C é particularmente eficaz, uma vez que em 85% dos casos essa doença é assintomática e vai para a fase crônica sem tratamento oportuno.

A detecção precoce do agente patogênico ajudará a evitar complicações e tratamento de longo prazo.

Exame abrangente de PCR

Análise abrangente de PCR: o que é isso? Trata-se de uma reação em cadeia da polimerase, que envolve a identificação de vários tipos de infecções ao mesmo tempo: micoplasma genitalium, micoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovírus, ureaplasma urealytikum, herpes simplex do 1º e 2º tipos, gonorréia, sífilis, papilomavírus, papilomavírus, papilomavite, herpesite do 1º e 2º tipos, gonorréia e pymplasma. O preço de tais diagnósticos varia de 2.000 a 3.500 rublos. dependendo da clínica, materiais e equipamentos usados, bem como o tipo de análise: qualitativa ou quantitativa. O que é necessário no seu caso - o médico decidirá. Em alguns casos, basta apenas determinar a presença do patógeno, em outros, por exemplo, no caso da infecção pelo HIV, um papel importante é desempenhado pelo título quantitativo. Ao diagnosticar todos os patógenos acima, a pesquisa é chamada de "análise PCR-12".

Decifrando os resultados da análise

A decodificação da análise de PCR é fácil. Existem apenas 2 escalas do indicador - “resultado positivo” e “resultado negativo”. Quando um patógeno é detectado, os médicos podem, com 99% de certeza, confirmar a presença da doença e proceder ao tratamento do paciente. No método quantitativo de determinação da infecção na coluna apropriada será indicado um indicador numérico de bactérias detectadas. Apenas um médico pode determinar a extensão da doença e prescrever o tratamento necessário.

Em alguns casos, por exemplo, na determinação da infecção pelo HIV por PCR, com um resultado negativo, é necessário realizar exames adicionais para confirmar os indicadores obtidos.

Onde levar a análise?

Onde passar a análise PCR: na clínica pública ou em um laboratório particular? Infelizmente, nas instituições médicas municipais, o equipamento e os métodos são frequentemente desatualizados. Portanto, é melhor dar preferência a laboratórios privados com equipamentos modernos e pessoal altamente qualificado. Além disso, em uma clínica particular, você obterá resultados muito mais rápidos.

Em Moscou, muitos laboratórios privados oferecem análises de PCR para várias infecções. Por exemplo, em clínicas como Vita, Complex Clinic, Happy Family e Uro-Pro, eles analisam PCR. O preço da pesquisa é de 200 rublos. para a determinação de um patógeno.

Pode-se concluir que o diagnóstico de doenças infecciosas por PCR na maioria dos casos é uma forma rápida e confiável de detectar o patógeno no organismo nos estágios iniciais da infecção. Mas no entanto em certos casos vale a pena escolher outros métodos do diagnóstico. Apenas um especialista pode determinar a necessidade de tal estudo. A decodificação da análise de PCR também requer uma abordagem profissional. Siga as recomendações do médico e não faça seus próprios exames, que não são necessários.

As vantagens do diagnóstico por PCR na medicina moderna:

• Detecção direta da presença de um patógeno (ou seja, uma região específica do DNA ou RNA do patógeno) na amostra em estudo.
• Alta especificidade permite determinar uma região única de DNA ou RNA que é característica de um patógeno específico, o que elimina a possibilidade de reações falsas.
• A alta sensibilidade do método de PCR torna possível detectar até mesmo células únicas de patógenos (vírus, bactérias). A sensibilidade da análise de PCR é de 10-1000 células na amostra em estudo (por exemplo, a sensibilidade dos testes imunológicos e microscópicos é de apenas 103-105 células).
• Desenvolvimento de um método universal de PCR para detectar vários patógenos. O objeto de pesquisa por PCR é o material genético (DNA, RNA) do patógeno. A técnica permite identificar vários patógenos de uma única amostra biológica.
• Rápido o suficiente para obter o resultado da análise. A pesquisa cheia executa-se em 4-4.5 horas, menos muitas vezes - um pouco mais.
• A possibilidade de detectar patógenos antes do início dos sintomas (diagnóstico pré-clínico) e após a última doença (diagnóstico retrospectivo). Um exemplo de diagnóstico pré-clínico será o exame durante o período de incubação (desde o momento da infecção até a queixa do paciente), bem como a infecção latente (quando não há sintomas, mas apenas dados laboratoriais - PCR, por exemplo). Um dos pontos importantes do diagnóstico por PCR é a PCR em material de arquivo ou resíduos biológicos, o que é importante para a identificação de uma pessoa ou paternidade.

Atualmente, o diagnóstico de PCR está passando por um desenvolvimento significativo. O método em si está sendo aperfeiçoado, novos tipos de PCR aparecem de novo e de novo, novos sistemas de teste para essa reação estão chegando ao mercado médico. Devido a isso, o custo dos estudos de PCR a cada ano se torna mais acessível para uma ampla gama de pacientes.

O que é o método PCR baseado em?

A base da reação em cadeia da polimerase é repetida duplicação (amplificação) de uma determinada seção de DNA ou RNA com a ajuda de enzimas em laboratório. O resultado é a quantidade de DNA ou RNA suficiente para análise visual. No decorrer do estudo, apenas a área que se enquadra nas condições especificadas é copiada, e apenas na situação de sua presença na amostra em estudo.

Por exemplo, o material para o estudo, que assume a presença de fragmentos de DNA ou RNA do patógeno (saliva, sangue, urina, descarga dos genitais), é colocado em um reator especial (amplificador). Em seguida, são adicionadas enzimas específicas que se ligam ao DNA ou RNA do patógeno, e sua cópia é sintetizada. Essa cópia ocorre em vários estágios de um tipo de "reação em cadeia" e, por fim, centenas e milhares de cópias podem ser formadas a partir de uma única cópia do material genético. Depois, há uma análise e comparação do resultado com o banco de dados existente sobre a estrutura de vários patógenos. Através da PCR, é possível não apenas identificar o tipo de patógeno, mas também produzir um resultado quantitativo da análise, ou seja, quantos patógenos estão no corpo humano.

O método de PCR está atualmente expandindo o leque de oportunidades de pesquisa: introduzindo mutações, combinando fragmentos de DNA e é amplamente usado na medicina, por exemplo, para estabelecer a paternidade, o surgimento de novos genes e assim por diante.

Quais infecções podem ser detectadas usando o diagnóstico de PCR

1) infecção pelo HIV (pode detectar o vírus da imunodeficiência humana HIV-1)
2) Hepatite viral A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV)
3) mononucleose infecciosa (DNA do vírus Epstein-Barr-VEB)
4) Infecção por citomegalovírus (DNA-CMV)
5) Infecção por herpes (herpes simplex DNA - HSV tipo 1 e 2)
6) IST (infecções sexualmente transmissíveis) - ureaplasmosis, gardnerellosis, clamídia, micoplasmose, tricomoníase,
7) Tuberculose (Mycobacterium tuberculosis)
8) Vírus oncogênicos - infecção pelo papilomavírus humano (papilomavírus humano (incluindo suas espécies oncogênicas 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 e 59)
9) Borreliose, encefalite transmitida por carrapatos
10) Listeriose
11) Candida (fungos do gênero Candida)
12) Infecção por Helicobacter pylori (Helicobacter pylori)
e outros

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

O exame de infecções sexualmente transmissíveis (ISTs) em homens e mulheres envolve secreções dos órgãos genitais, um esfregaço ou raspagem do colo do útero, um esfregaço ou raspagem da uretra (uretra) e urina.

Ao examinar infecções (infecções por herpes, CMVI, mononucleose, toxoplasmose, hepatite B, C, infecção por HIV), o sangue é coletado em PCR.

Para o diagnóstico de mononucleose infecciosa, CMV, uma infecção herpética, um swab da garganta é tomado, para o teste de CMV - urina. Muitas vezes, para o exame de lesões do sistema nervoso, vários estudos coletam fluido espinhal.

Na pneumologia, o material é escarro, líquido pleural.

Ao examinar infecções intra-uterinas - líquido amniótico, tecido placentário.

Preparação para a entrega do material e os diagnósticos de PCR

Quase todos os pacientes submetidos a diagnósticos de PCR têm o direito de confiar em resultados confiáveis, precisos e rápidos, que dependem em grande parte da capacidade do laboratório e do profissionalismo do técnico de laboratório. Ao mesmo tempo, muitas pessoas não pensam que esta mesma confiabilidade depende em muitos aspectos de nós mesmos, ou seja, das recomendações do médico assistente, do modo de vida e da correção da amostragem do material. Ao retirar o material, são necessárias condições que excluam a contaminação (contaminação) do material e, consequentemente, questionem a objetividade da análise.

A preparação adequada para a entrega do material não é particularmente difícil. As seguintes recomendações médicas para pacientes existem:

1) não ter vida sexual no dia anterior à entrega do material,
2) o sangue da pesquisa rende-se de manhã em um estômago vazio (não comer, não beber),
3) após a entrega da urina, a primeira porção matinal é coletada em um recipiente estéril limpo.

Explicação dos resultados da PCR

Negativo o resultado da PCR indica que não foram encontrados traços de agentes infecciosos no material em estudo no momento do parto. A maioria dos casos mostra a ausência de infecção, que eles tentaram encontrar no teste.

Positivo o resultado da PCR indica a detecção de traços de infecção na amostra biológica em estudo. Com grande precisão, um resultado positivo indica a presença de uma infecção em um determinado ponto no tempo.

Há situações em que PCR é positivo, e é impossível falar sobre infecção ativa - esse é o chamado “estado de portador saudável”, sem sintomas clínicos da doença, que não requer tratamento, mas requer observação dinâmica de um médico. Observa-se mais freqüentemente em várias infecções virais (HPV, CMVI, infecção por EBV, infecção por herpes, etc.) em materiais como saliva, raspagem do canal cervical, uretra, isto é, do foco local. No entanto, não devemos esquecer que a transmissão de portadores para pessoas saudáveis ​​é possível, assim como a transição para a forma crônica da doença com o processo de ativação. Se PCR é positivo no sangue, então não é mais um estado de portador e requer tratamento específico.

O resultado quantitativo da PCR é avaliado apenas por um médico individualmente para uma infecção separadamente e não possui gradações comuns. Com base no resultado quantitativo da PCR, o médico pode determinar o grau de atividade da infecção e definir o estágio da doença, o que certamente afetará o curso e as doses dos medicamentos prescritos.

Uma das últimas questões interessantes: quão preciso é o diagnóstico de PCR?

Para análise de PCR, existem 3 definições:

1. Precisão (com alta probabilidade de possível detecção ou ausência de infecção).
2. Especificidade (precisão da detecção de uma infecção específica).
3. Sensibilidade (mesmo com um baixo conteúdo de material genético de patógenos na amostra em estudo, a infecção será detectada).

A reação em cadeia da polimerase quase não produz resultados falso-positivos (ou seja, não há amostras positivas onde não há infecção). Resultados falso-negativos são raramente observados (mais frequentemente está associado à ausência de infecção ativa em uma pessoa no momento). Por exemplo, infecção latente, infecção crônica fora da atividade.

O conteúdo

No início dos anos 1970, o cientista norueguês Kjell Kleppe, do laboratório do Prêmio Nobel Khara Gobinda Quran, propôs um método para amplificar o DNA usando um par de moléculas curtas de DNA de fita única - primers sintéticos [1]. No entanto, naquela época, essa ideia não foi cumprida. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada em 1983 pelo bioquímico norte-americano Carey Mullis [2] [3]. Seu objetivo era criar um método que permitisse a amplificação de DNA no decurso de múltiplas duplicações sucessivas da molécula de DNA original usando a enzima DNA polimerase. A primeira publicação sobre o método de PCR apareceu em novembro de 1985 na revista Science [4]. O método revolucionou a biologia molecular e a medicina. Em 1993, Carey Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química por isso. [5]

No início da utilização do método, após cada ciclo de aquecimento-arrefecimento, a polimerase de ADN teve de ser adicionada à mistura reaccional, uma vez que foi inactivada à temperatura elevada necessária para a separação das cadeias de hélice de ADN. O procedimento da reação foi relativamente ineficiente, demandando muito tempo e enzima. Em 1986, o método de reação em cadeia da polimerase foi significativamente melhorado. Foi proposto o uso de DNA polimerases de bactérias termofílicas [6]. Estas enzimas foram termoestáveis ​​e foram capazes de suportar muitos ciclos de reação. Seu uso permitiu simplificar e automatizar o PCR. Uma das primeiras DNA polimerases termoestáveis ​​foi isolada de bactérias Thermus aquaticus e nomeado Taq-polimerase. A desvantagem desta polimerase é a probabilidade bastante alta de introduzir um nucleotídeo errôneo, uma vez que esta enzima não possui mecanismos para corrigir erros (atividade 3 '→ 5'-exonuclease). Polimerase Pfu e Pwo, isolados de arqueas, têm esse mecanismo, seu uso reduz significativamente o número de mutações no DNA, mas sua velocidade (processividade) é menor do que a de Taq. Agora aplique a mistura Taq e Pfupara alcançar simultaneamente alta velocidade de cura e alta precisão de cópia.

Na época da invenção do método, Carey Mullis trabalhou como químico sintético (ele sintetizou oligonucleotídeos, que foram então usados ​​para identificar mutações pontuais por hibridação com DNA genômico) em Cetus (Cetus Corporation), que patenteou o método de PCR. Em 1992, a Cetus vendeu os direitos do método e da patente para usar Taq-polymerase empresa Hofman-La Roche por US $ 300 milhões. No entanto, descobriu-se que Taq-polimerase foi caracterizada pelos bioquímicos soviéticos A. Kaledin, A. Slusarenko e S. Gorodetsky em 1980 [7], e 4 anos antes desta publicação soviética, isto é, em 1976, pelos bioquímicos americanos Alice Chien, David B. Edgar e John M. Trela. [8] A este respeito, a empresa Promega tentou judicialmente forçar Rosh a renunciar aos direitos exclusivos desta enzima [9]. Uma patente dos EUA para PCR expirou em março de 2005.

O método baseia-se na cópia seletiva repetida de uma determinada seção do ácido nucléico do DNA com a ajuda de enzimas sob condições artificiais (in vitro). Quando isso acontece, apenas a área que atende às condições especificadas é copiada e somente se estiver presente na amostra em estudo. Ao contrário da amplificação de DNA em organismos vivos (replicação), seções relativamente curtas de DNA são amplificadas por PCR. Em um processo de PCR convencional, o comprimento das seções de DNA a serem copiadas não é superior a 3.000 pares de bases (3 kpb [10]). Usando uma mistura de polimerases diferentes, com o uso de aditivos e sob certas condições, o comprimento do fragmento de PCR pode alcançar 20-40 mil pares de bases. Ainda é significativamente menor que o comprimento do DNA cromossômico da célula eucariótica. Por exemplo, o genoma humano consiste em cerca de 3 bilhões de pares de bases [11].

Componentes da Reação Editar

No caso mais simples, os seguintes componentes são necessários para PCR:

  • Matriz de DNAcontendo o DNA que precisa ser amplificado.
  • Dois primerscomplementar às extremidades opostas das diferentes cadeias do fragmento de DNA desejado.
  • Termoestável DNA polimerase - Enzima que catalisa uma reação de polimerização de DNA. A polimerase para uso em PCR deve permanecer ativa a altas temperaturas por um longo período, portanto, enzimas isoladas de termofílicos são utilizadas - Thermus aquaticus (Taq-polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu-polimerase), Pyrococcus woesei (Pwo-polimerase), Thermus thermophilus (Tthpolimerase) e outros.
  • Trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Íons Mg 2+ necessários para a operação da polimerase.
  • Solução tampãofornecendo as condições de reação necessárias - pH, força iônica da solução. Contém sal, albumina de soro bovino.

De modo a evitar a evaporação da mistura reaccional, adiciona-se ao tubo um óleo com elevado ponto de ebulição, por exemplo óleo de vaselina. Se uma tampa de aquecimento é usada, isso não é necessário.

A adição de pirofosfatase pode aumentar o rendimento da reação de PCR. Esta enzima catalisa a hidrólise do pirofosfato, um subproduto da adição de trifosfatos de nucleotídeos a uma cadeia de DNA em crescimento, ao ortofosfato. O pirofosfato pode inibir a reação de PCR [12].

Primers Editar

A especificidade da PCR é baseada na formação de complexos complementares entre a matriz e os primers, curtos oligonucleotídeos sintéticos de 18-30 bases de comprimento. Cada um dos primers é complementar a uma das cadeias da matriz de fita dupla e limita o início e o fim da região amplificada.

Após a hibridização da matriz com o primer (anelamento [13]), este último serve como um primer para a DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar da matriz (ver abaixo).

A característica mais importante dos primers é o ponto de fusão (Tma) matriz de primer complexa.

Tm - a temperatura a que metade do molde de ADN forma um complexo com um iniciador oligonucleotico. Fórmula de contagem média Tm para um oligonucleótido curto (e para fragmentos de ADN longos), tendo em conta a concentração de iões K + e DMSO:

onde L é o número de nucleotídeos no primer, K + é a concentração molar de íons de potássio, G + C é a soma de todas as guaninas e citosinas.

No caso de uma escolha incorreta do comprimento e composição nucleotídica do primer ou da temperatura de anelamento, é possível a formação de complexos parcialmente complementares com outras regiões do DNA molde, o que pode levar ao aparecimento de produtos inespecíficos. O limite superior do ponto de fusão é limitado pela temperatura ótima da polimerase, cuja atividade cai a temperaturas acima de 80 ° C.

Ao escolher primers, é desejável aderir aos seguintes critérios:

40—60 %,

  • fechar tm primários (diferenças não superiores a 5 ° C),
  • a ausência de estruturas secundárias não específicas - grampos [15] e dímeros [16],
  • É desejável que guanina ou citosina estejam presentes no terminal 3, uma vez que formam três pontes de hidrogênio com a molécula da matriz, tornando a hibridização mais estável.
  • Amplificador Editar

    PCR é realizado em termociclador - um dispositivo que fornece resfriamento periódico e aquecimento dos tubos, geralmente com uma precisão de pelo menos 0,1 ° C. Amplificadores modernos permitem que você defina programas complexos, incluindo a possibilidade de "início a quente", PCR de aterrissagem (veja abaixo) e o armazenamento subsequente das moléculas amplificadas a 4 ° C. Para PCR em tempo real, são produzidos instrumentos equipados com um detector fluorescente. Há também dispositivos com uma tampa automática e um compartimento de microplacas, o que permite que eles sejam incorporados em sistemas automatizados.

    Normalmente, 20-35 ciclos são realizados durante a PCR, cada um dos quais consiste em três etapas (Fig. 2).

    Edição de desnaturação

    O molde de DNA de cadeia dupla é aquecido a 94–96 ° C (ou até 98 ° C, se for utilizada uma polimerase termoestável particularmente estável) por 0,5 a 2 min, de modo que as cadeias de DNA sejam separadas. Este estágio é chamado de fusão (desnaturação)porque as ligações de hidrogênio entre dois filamentos de DNA são destruídas. Normalmente, antes do primeiro ciclo, um longo aquecimento da mistura reaccional é realizado durante 2-5 minutos para desnaturar completamente o molde e os iniciadores.

    Edição de recozimento

    Quando as cadeias são separadas, a temperatura é diminuída para que os primers possam se ligar à matriz de fita simples. Este estágio é chamado recozimento. A temperatura de recozimento depende da composição do primer e é usualmente escolhida 5 graus abaixo do ponto de fusão dos primers. A escolha errada da temperatura de emparelhamento leva à fraca ligação dos primers à matriz (a temperatura elevada) ou à ligação no local errado e ao aparecimento de produtos não específicos (a baixa temperatura). O tempo da fase de recozimento é de 30 segundos e, ao mesmo tempo, a polimerase já tem tempo de sintetizar várias centenas de nucleotídeos. Portanto, recomenda-se selecionar primers com um ponto de fusão acima de 60 ° C e realizar o recozimento e o alongamento simultaneamente, a 60-72 ° C.

    Alongamento Editar

    A DNA polimerase replica a cadeia modelo usando o primer como semente. Este é o palco alongamento. A polimerase inicia a síntese da segunda cadeia a partir da extremidade 3 'do primer que está associada à matriz, e se move ao longo da matriz, sintetizando uma nova cadeia na direção da extremidade 5' para 3 '. A temperatura de alongamento é dependente da polimerase. Polimerases freqüentemente usadas Taq e Pfu mais ativo a 72 ° C. O tempo de alongamento depende tanto do tipo de DNA polimerase quanto do comprimento do fragmento amplificado. Normalmente, o tempo de alongamento é igual a um minuto para cada mil pares de bases. Após o final de todos os ciclos, muitas vezes é realizado um estágio adicional. alongamento finalpara completar todos os fragmentos de cadeia única. Este estágio dura 7-10 minutos.

    A quantidade de um produto de reação específico (limitado por primers) teoricamente aumenta proporcionalmente a 2 n - 2n, onde n é o número de ciclos de reação [17]. De fato, a eficiência de cada ciclo pode ser menor que 100%, então, na realidade, P

    (1 + E) n, onde P é a quantidade do produto, E é a eficiência média do ciclo.

    O número de cópias "longas" de DNA também está crescendo, mas linearmente, então um fragmento específico domina os produtos da reação.

    O crescimento do produto requerido em progressão geométrica é limitado pela quantidade de reagentes, a presença de inibidores, a formação de subprodutos. Nos últimos ciclos da reação, o crescimento diminui, isto é chamado de “efeito platô”.

    • RPA (Inglês Recombinase Polymerase Amplification - Recombinase polimerase amplificação) - usado onde amplificação de DNA / RNA é necessária por 15 minutos sem termociclador (reação isotérmica) [18] [19]
    • PCR aninhada (Nested PCR (Eng.)) - usado para reduzir o número de subprodutos da reação. Dois pares de primers são usados ​​e duas reações sucessivas são realizadas. O segundo par de primers amplifica uma região de DNA dentro do produto da primeira reação.
    • PCR invertido (PCR Inversa (Eng.)) - é usado se apenas uma pequena parte da seqüência desejada for conhecida. Este método é especialmente útil quando é necessário determinar sequências adjacentes após a inserção do DNA no genoma. Para a implementação da PCR invertida, é realizada uma série de cortes de DNA com restosites, seguida da ligação dos fragmentos (ligação). Como resultado, os fragmentos conhecidos aparecem em ambas as extremidades da região desconhecida, após o que a PCR pode ser realizada como habitualmente.
    • PCR com transcrição reversa (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (Inglês)) - usado para amplificar, isolar ou identificar uma sequência conhecida de uma biblioteca de RNA. Antes da PCR convencional, uma molula de ADN de cadeia simples sintetizada no molde de ARNm utilizando revertase e obtido um ADNc de cadeia simples, que utilizado como molde para a PCR. Este método geralmente determina onde e quando esses genes são expressos.
    • PCR assimétrico (Inglês PCR Assimétrica) - é realizado quando você precisa amplificar principalmente uma das cadeias do DNA original. Usado em alguns ensaios de sequenciamento e hibridização. PCR é realizado como de costume, exceto que um dos primers é levado em grande excesso. Modificações deste método é o inglês.Linear-UmdepoisThe-EA PCR xponencial (LATE-PCR), que utiliza primers com diferentes concentrações, e um primer de baixa concentração é escolhida com um ponto de fusão maior (ponto de fusão) do que um primer de alta concentração. A PCR é realizada a uma temperatura de recozimento elevada, sendo assim possível manter a eficiência da reação ao longo de todos os ciclos [20].
    • PCR quantitativa (PCR quantitativo, Q-PCR (em Inglês)) ou PCR em tempo real - usado para observação direta da medição da quantidade de um produto de PCR específico em cada ciclo de reação. Este método utiliza primers marcados fluorescentemente ou sondas de DNA para medir com precisão a quantidade do produto da reação conforme ele se acumula, ou um corante intercalante fluorescente é usado. Sybr green i (mas melhor usar SYTO 13), que se liga ao DNA de cadeia dupla. Sybr green i fornece uma opção simples e econômica para a detecção e quantificação de produtos de PCR durante a PCR em tempo real, sem a necessidade de sondas ou primers fluorescentes específicos. Durante o corante de amplificação SYBR Green I Ele é inserido no sulco menor do DNA dos produtos de PCR e emite um sinal fluorescente, mais forte que o do corante não ligado, quando irradiado com um laser azul. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Os primeiros ciclos são realizados a uma temperatura acima da temperatura ideal de recozimento e, depois, a cada vários ciclos, a temperatura de recozimento é gradualmente reduzida ao ideal. Isto é feito para assegurar que o primer hibridize com a cadeia complementar ao longo de todo o seu comprimento, enquanto que na temperatura de recozimento ótima, o primer se hibridiza parcialmente com a cadeia complementar. A hibridao parcial de um iniciador no ADN genico leva a uma amplificao n especica, se houver alguns locais de ligao para o iniciador. Na maioria dos casos, os primeiros dez ciclos de PCR podem ser realizados a uma temperatura de recozimento de 72-75 ° C e, em seguida, imediatamente reduzidos para o ideal, por exemplo, para 60-65 ° C.
    • Método de Colônia Molecular (PCR em gel, Inglês Colony - PCR Colony) - polimerização em gel de acrilamida com todos os componentes de PCR na superfície e realizar PCR. Nos pontos que contêm o DNA analisado, a amplificação ocorre com a formação de colônias moleculares.
    • PCR com amplificação rápida de extremidades de cDNA (nascido de amplificação rápida de extremidades de cDNA, RACE-PCR).
    • PCR de fragmentos longos (eng. PCR de longo alcance) - modificação de PCR para amplificação de regiões estendidas de DNA (10 mil ou mais bases). Use uma mistura de duas polimerases, uma das quais - Taq-polimerase com alta processabilidade (que é capaz de sintetizar uma longa cadeia de DNA em uma única passagem), e a segunda é uma DNA polimerase com atividade de exonuclease 3'-5 ', geralmente polimerase Pfu. A segunda polimerase é necessária para corrigir os erros introduzidos em primeiro Taq-polimerase pára a síntese de DNA se um nucleotídeo não complementar tiver sido adicionado. Este nucleótido não complementar remove a polimerase Pfu. Uma mistura de polimerases é obtida na proporção de 50: 1 ou até menos que 100: 1, Taq-polimerase é tomada 25-100 vezes mais do que Pfupolímeros.
    • Rapd A amplificação aleatória de DNA polimórfico - PCR com amplificação aleatória de DNA polimórfico - é usada quando é necessário distinguir organismos similares em seqüência genética, por exemplo, diferentes variedades de plantas cultivadas, raças de cães ou microrganismos intimamente relacionados. Neste método, um pequeno primer (cerca de 10 pb) é geralmente usado. Este primer será parcialmente complementar às regiões aleatórias de DNA dos organismos estudados. Ao selecionar as condições (comprimento do primer, sua composição, temperatura, etc.), é possível obter uma diferença satisfatória no padrão de PCR para os dois organismos.
    • PCR específico para grupos (PCR especica de grupo) - PCR para sequcias relacionadas dentro de uma ou entre espies diferentes utilizando iniciadores conservativos para estas sequcias. Por exemplo, seleção de primers universais para genes ribossômicos 18s e 26s para amplificação de um espaçador intergênico espécie-específico: seqüência gênica 18s e 26s conservativo entre espécies, portanto, a PCR entre esses genes será realizada para todas as espécies estudadas. O oposto deste método é PCR exclusivo (eng. PCR exclusivo), onde a tarefa é selecionar primers para amplificar apenas uma seqüência de todos os relacionados.
    • PCR usando início a quente (Inglês Hot-start PCR) - modificação da PCR utilizando DNA polimerase, na qual a atividade da polimerase é bloqueada à temperatura ambiente com anticorpos ou pequenas moléculas do tipo Affibody que imitam anticorpos, ou seja, no momento de definir a reação antes da primeira desnaturação em PCR. Tipicamente, a primeira desnaturação é realizada a 95 ° C durante 10 minutos.
    • PCR virtual (por PCR in silico, PCR digital, PCR eletrônica, e-PCR) é um método matemático de análise computacional de uma reação em cadeia da polimerase usando uma lista de sequências de primers (ou sondas de DNA) para prever o potencial amplificação do DNA do genoma, cromossomo, DNA circular ou qualquer outro pedaço de DNA.

    Se a seqüência de nucleotídeos do modelo é parcial ou desconhecida, você pode usar primers degeneradoscuja seqüência contém posições degeneradas nas quais qualquer base pode ser localizada. Por exemplo, a sequência de primers pode ser: ... ATH ...onde H é A, T ou C.

    PCR é usado em muitas áreas para análise e em experimentos científicos.

    Forense Editar

    A PCR é usada para comparar as chamadas "impressões digitais genéticas". Uma amostra do material genético da cena do crime - sangue, saliva, sêmen, pêlos, etc. - é necessária, comparada ao material genético do suspeito. Uma quantidade muito pequena de DNA é suficiente, teoricamente, uma cópia. O DNA é clivado em fragmentos, depois amplificado por PCR. Os fragmentos são separados por eletroforese de DNA. O padrão resultante do arranjo das bandas de DNA é chamado impressão digital genética (impressão genética genética).

    Diagnóstico Médico Editar

    A PCR permite acelerar e facilitar significativamente o diagnóstico de doenças hereditárias e virais. O gene desejado é amplificado por PCR usando primers apropriados, e então sequenciado para determinar as mutações. Infecções virais podem ser detectadas imediatamente após a infecção, semanas ou meses antes que os sintomas da doença apareçam.

    Medicina personalizada Editar

    Às vezes, as drogas são tóxicas ou alergênicas para alguns pacientes. As razões para isso são, em parte, diferenças individuais na suscetibilidade e metabolismo de drogas e seus derivados. Essas diferenças são determinadas no nível genético. Por exemplo, em um paciente, um certo citocromo (proteína do fígado, responsável pelo metabolismo de substâncias estranhas) pode ser mais ativo, em outro - menos. Para determinar que tipo de citocromo este paciente possui, propõe-se realizar a análise de PCR antes de usar o medicamento. [ fonte não especificada 3300 dias ] Tal análise é denominada genotipagem preliminar (genotipagem prospectiva em inglês).

    Clonagem de genes

    A clonagem de genes (não confundir com a clonagem de organismos) é o processo de isolar genes e, como resultado de manipulações de engenharia genética, obter uma grande quantidade do produto de um dado gene. A PCR é usada para amplificar um gene, que é então inserido em vector - fragmento de DNA que carrega um gene alienígena no mesmo ou em outro, conveniente para o crescimento do organismo. Como vectores, por exemplo, são utilizados plasmídeos ou ADN viral. A inserção de genes em um organismo estranho é geralmente usada para obter o produto desse gene - RNA ou, na maioria das vezes, proteína. Assim, em quantidades industriais, muitas proteínas são obtidas para uso na agricultura, medicina, etc.

    Sequenciamento de DNA

    No método de sequenciação utilizando um isótopo marcado radioactivamente ou fluorescentemente de didesoxinucleótidos, a PCR é uma parte integrante, uma vez que é durante a polimerização que nucleótidos marcados com um marcador fluorescente ou radioactivo são inseridos na cadeia de ADN. A adição do didesoxinucleótido à cadeia sintetizada conduz a uma quebra na síntese, tornando possível determinar a posição de nucleótidos específicos após separação no gel.

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